Экспериментальная часть

Из данных, приведенных в табл. 1 и 2, видно, что азот препаратов обладает различной степенью подвижности.
В результате прямого, а также последовательного гидролиза гуминовой кислоты из чернозема в раствор переходило 40—44% всего азота,, тогда как в гидролизатах фульвокислот этой же почвы и гуминовой кислоты из подзолистой почвы процент перешедшего в раствор азота составлял 73—75%. В случае же новообразованных гумусовых веществ эта величина достигала 87,8% (табл. 2).
Заслуживает внимания тот факт, что значительная часть всего количества подвижного азота переходила в раствор уже при кратковременном гидролизе 2%-ной НС1. Но и в этом случае наиболее легко гидролизуется азот фульвокислот. Эти положения иллюстрируются данными табл. I (см. последнюю графу таблицы).
Полученные результаты позволяют сделать вывод о различных формах соединений азота гумусовых веществ различного происхождения. Так, судя по количеству переходящего в гидролизат азота, в наименее подвижных формах он присутствует в гуминовых кислотах, выделенных из черноземной почвы, которые характеризуются наибольшей степенью конденсированности частиц. Что касается гуминовой кислоты подзолистой почвы и особенно фульвокислот, то здесь, по-видимому, азот представлен несколько более простыми, легкогидролизуемыми формами. То же можно сказать и в отношении новообразованных гумусовых веществ, где нерастворимая фракция азота составляет всего лишь 12% от общего его содержания.
Не исключено также, что большая или меньшая способность азота различных гумусовых веществ переходить в раствор при кислом гидролизе может быть объяснена различным положением азота в их частицах.
Если принять, что последние содержат ароматическую сетку циклически полимеризованного углерода и боковые цепи линейно-полимеризованного углерода, то положение азота в ароматической сетке (как, например, в случае гуминовой кислоты чернозема) несомненно будет иметь следствием меньшую его подвижность, нежели в случае расположения в боковых цепях (как, например, в гуминовых кислотах подзолистой почвы и особенно в фульвокислотах).
Этот интересный вопрос требует, однако, дальнейших исследований.
При помощи метода распределительной хроматографии на бумаге нами изучался аминокислотный состав полученных гидролизатов гумусовых веществ.
Гидролизаты наносились на бумагу (производства Ленинградской фабрики им. Володарского, вып. 1955 г.) в виде небольших капель микропипеткой. Расстояния между каплями равнялись 2,5—3 см. Количества наносимых гидролизатов уравнивались по содержанию органического азота, т. е. за вычетом аммиака.
Разделение аминокислот производилось одномерным нисходящим способом. В качестве растворителя применялась смесь п-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5.
Наиболее четкое разделение аминокислот получалось в том случае, когда бумага с нанесенными каплями помещалась в камеру с растворителем на два срока — 40 час и затем после кратковременного высушивания на воздухе — еще на 24 часа.
С целью облегчения идентификации аминокислот мы ставили две параллельные хроматограммы. По прошествии указанных выше сроков одна из них обрабатывалась 0,2%ным раствором нингидрина в п-бутиловом спирте, другая — 1%ным раствором изатина в спирте с добавлением ацетата и ледяной уксусной кислоты (метод Бояркина — Институт физиологии растений АН СССР).
Преимущество последнего способа обработки заключается в том, что он дает на желтом фоне пятна различных цветов. Предварительно устанавливали при помощи специальной хроматограммы растворов чистых препаратов аминокислот («метчики») соответствие различно окрашенных пятен той или иной аминокислоты. Обработка изатином, кроме
того, позволяет выявить некоторые аминокислоты, например: пролин, тирозин, фенилаланин, которые с трудом проявляются при обработке нингидрином
На фото представлена хроматограмма гидролизатов изучаемых нами гумусовых веществ. Расшифровка цифровых обозначений дана в табл. 3, в которой наибольшая степень интенсивности пятен условно обозначена тремя крестами.
Судя по интенсивности окраски пятен на хроматограмме, концентрация аминокислот в растворах после гидролиза 6-я НС1 во всех случаях выше, чем в растворах после гидролиза 2%-ной НС1, хотя в последние, как указывалось выше, переходит большая часть всего азота препаратов. Учитывая, что наносимые на бумагу количества гидролизатов уравнивались по содержанию органического азота, эти данные подтверждают положение о присутствии в гуминовых кислотах некоторой части органического азота в формах не типичных протеинов, а более простых соединений.
Отсутствие существенных различий в аминокислотном составе гидролизатов почвенных гуминовых кислот и фульвокислот, равно как и новообразованных гумусовых веществ, выделенных из культуральной жидкости АзрегдШиз ш§ег, указывает на сходство путей образования исследуемых объектов и участие в формировании их частиц азота микробного происхождения.
Выводы
1. Изучались формы азота почвенных гуминовых кислот и фульво-кислот, а также новообразованных гумусовых веществ, выделенных из культуральной жидкости плесневого гриба.
2. При последовательном гидролизе гумусовых веществ с помощью 2%-ной НС1 в течение 2*/г час., а затем с 6-п НС1 в течение 20 час. были выявлены различия в степени подвижности азота различных препаратов. В случае гуминовой кислоты чернозема в первую фракцию гидролизата переходит 26,6% всего азота, тогда как у фульвокислот количество перешедшего в раствор азота при слабом гидролизе достигает 70% от общего количества. Промежуточное положение занимают гуминовые кислоты из подзолистой почвы и новообразованные гумусовые вещества из культуры.
3. Указанные различия степени подвижности азота могут быть объяснены не только различными формами его соединений, но и неодинаковым положением в частицах различных гумусовых веществ.
4. При помощи метода распределительной хроматографии на бумаге в кислых гидролизатах гумусовых веществ было обнаружено до 16 аминокислот: цистин, лизин, гистидин (последний везде, за исключением фульвокислот чернозема), аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, гликокол, серин, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, метионин, фенилаланин, лейцины. Эти данные свидетельствуют о протеиновой природе значительной части гумусовых веществ.
5. Отсутствие заметных различий в аминокислотном составе изучаемых препаратов говорит о качественной близости их протеиновых фракций, что позволяет судить о сходстве путей формирования различных групп гумусовых веществ.
6. Присутствие протеинового азота среди продуктов автолиза плесневого гриба подтверждает положение об участии в формировании первичных частиц гумусовых веществ азота микробного происхождения.